Новые аппаратурные решения для контроля и управления процессом культивирования.

В настоящей статье рассмотрены вопросы влияния факторов среды на процессы культивирования клеток, приведен краткий обзор современных аппаратурных решений для контроля параметров питательной среды. Показано, что использование биотехнологических анализаторов позволяет более информативно изучать процессы культивирования микроорганизмов (клеток млекопитающих и др).

Введение

Важнейшей целью технолога при проектировании и эксплуатации ферментационного отделения любого биотехнологического производства является обеспечение максимально благоприятных условий для роста культуры, увеличения выхода целевого продукта. Это касается как поддержания заданной температуры процесса, уровня pH, так и состава и свойств питательной среды. Состав питательных сред должен в наибольшей мере соответствовать потребностям штамма-продуцента. В непрерывнодействующих процессах культивирования задача технолога сводится, в конечном итоге, к постоянному поддержанию необходимых концентраций питательных веществ (и кислорода) в ходе промышленной эксплуатации ферментера и дозированному введения кислоты/щелочи для pH-статирования. Более сложные проблемы возникают при производстве метаболитов, когда в ходе периодического процесса культивирования состав среды, окружающей клетки штамма-продуцента, должен изменяться в зависимости от фазы роста культуры, ее состояния и уровня активности. Именно это обстоятельство затрудняет перевод такого рода производств на непрерывный режим эксплуатации, да и при периодическом режиме требует от обслуживающего персонала постоянного контроля и управления процессом.

Для решения этих задач современный этап развития промышленной биотехнологии требует надежных экспресс-методов количественного изучения свойств живых клеток как продуцента целевого продукта, а также концентрации питательных веществ и метаболитов. В последние годы разрабатываются и внедряются новые аппаратурные решения для всестороннего экспресс-контроля культуры и питательной серды. Относительно новым классом подобных приборов являются биотехнологические анализаторы, с помощью которых можно получать данные о концентрации питательных веществ и метаболитов в культуральной среде в режиме онлайн. Принцип работы таких анализаторов основан на биосенсорных технологиях, использование которых позволяет получать точные воспроизводимые результаты в течение 1-2 мин.

Обзор основных факторов культуральной среды и их роли в процессе культивирования

В таблице 1 приведены факторы культуральной среды, которые определяют рост и биосинтетическую активность продуцентов. Рассмотрим данные факторы и методы управления ими более подробно.

Состав и концентрация питательных веществ определяют метаболизм клеток-продуцентов. В зависимости от типа процесса в качестве таких веществ могут выступать глюкоза, сахароза, лактоза, ксилоза, крахмал, целлюлоза, этанол и др. Состав питательных веществ определяется на этапе составления композиции питательной среды, а концентрация может поддерживаться или меняться в ходе ферментации в зависимости от способа.

При периодическом способе культивировании в ферментер загружают сразу весь объем питательной среды и вносят посевной материал. Выращивание микроорганизмов проводят в оптимальных условиях в течение определенного времени, после чего процесс останавливают, сливают содержимое ферментера и выделяют целевой продукт. Этап роста культуры включает: лаг-фазу, экспоненциальную фазу, фазу замедления роста, стационарную фазу, фазу отмирания.

Широко применяют периодическое культивирование с подпиткой. Существует также объемно-доливочное культивирование, когда часть объема из биореактора время от времени изымается при добавлении эквивалентного объема среды (полунепрерывное культивирование).

При непрерывном способе питательная среда непрерывно подается в ферментер (биореактор), в котором создают оптимальные условия для роста микроорганизмов, а из ферментера (биореактора) также непрерывно вытекает культуральная жидкость вместе с микроорганизмами. В непрерывных процессах биообъект поддерживается в экспоненциальной фазе роста. При этом существует равновесие между приростом биомассы за счет деления клеток и их убылью в результате разбавления свежей средой.

Продукты метаболизма (например, лактата или аммиака) и ингибиторы замедляют биохимические реакции, а следовательно, и в целом процесс ферментации. Такие вещества следует выводить из среды ферментации. Для этой цели в настоящий момент могут быть использованы ряд инструментальных решений, например, ротационный фильтр. (Роторный фильтр основан на технологии просеивания при вращении. Он может быть вставлен непосредственно в сосуд биореактора или использоваться как внешняя проточная система. В первом случае преимущество состоит в компактности системы.)

Значение pH и температуры регулируют скорость биохимических реакций. Кислотность питательной среды особое значение имеет для биохимических реакций, протекающих в клетках-продуцентах. Концентрация в растворе ионов водорода оказывает влияние на физико-химические свойства и биологическую активность белков и нуклеиновых кислот, поэтому для оптимального протекания культивирования поддержание кислотно-основного гомеостаза является задачей исключительной важности. В ферментере постоянное значение pH поддерживается путем дозирования щелочи/кислоты. В зависимости от природы продуцента оптимальный диапазон значения pH могут различаться. Например, при культивировании большинства патогенных бактерий оптимальна слабощелочная среда (рН 7,2—7,4). Исключение составляют холерный вибрион — его оптимум находится в щелочной зоне (рН 8,5—9,0) и возбудитель туберкулеза, нуждающийся в слабокислой реакции (рН 6,2—6,8).

Задача термостатирования, то есть поддержания постоянной температуры процесса  в диапазоне 2-3 градусов, аппаратурно решается с помощью термостатирующих рубашек (водяных, воздушных  и др). Например, оптимальная температура культивирования клеток млекопитающих составляет составляет +36-37 градусов, насекомых +20-25 градусов.

Осмотическое давление является важнейшим физиологическим параметром, в ходе культивирования оно поддерживается с помощью разбавления или добавления новых порций среды. Величина осмотического давления питательных сред в основном зависит от концентрации NaCl, оптимальное значение при +38 градусов составляет 7,6 атм.

Технологическое оформление биотехнологических процессов в сильной степени определяется отношение микроорганизма – продуцента к кислороду. Культуры бывают как аэробные, так и анаэробные. В первом случае кислород обеспечивает метаболизм. Анаэробная ферментация может проводиться в условиях полной защиты  культуральной среды от кислорода (если микроорганизмы являются облигатными анаэробами) или просто без подачи дополнительной кислородной смеси.

Углекислый газ служит источником углерода для автотрофов. Некоторые гетеротрофные микроорганизмы нуждаются в нем, а некоторые наоборот замедляют метаболизм в присутствии СО_2. Поэтому концентрация углекислого газа во многих случаях является важным параметром процесса ферментации.

Конструкция мешалки ферментера, а также скорость ее вращения регулирует процессы массопереноса, трансфера питательных веществ  к продуцентам и отвода метаболитов.

Таблица1. Основные факторы среды, определяющие рост и биосинтетическую активность продуцентов.

Возможности современных ферментеров для контроля и управления факторами среды. Биотехнологические анализаторы

Ферментер (биореактор) занимает ключевое место в аппаратурном оформлении биотехнологического процесса. Он представляет собой аппарат для глубинного выращивания (культивирования) микроорганизмов (или культур клеток) в питательной среде в условиях стерильности, интенсивного перемешивания, непрерывного продувания стерильным воздухом и постоянной температуры.

Современные ферментационные аппараты позволяют контролировать и управлять процессом культивирования клеток и добиваться высоких результатов в получении целевого продукта. Однако даже самый современный ферментер не позволит технологу контролировать и управлять всеми факторами среды (см. табл. 1). Во многих случаях технолог или оператор ферментационного отделения вынужден использовать рутинные методики для определения, например, концентрации метаболитов или питательных веществ. В качестве альтернативы рутинным методикам в последнее время широкое распространение получили биотехнологические анализаторы. Их работа основана на использовании биосенсоров, время выполнения анализа составляет 1-2 мин.

Данные о биотехнологическом процессе, полученные с помощью ферментера и биотехнологического анализатора, являются мощным инструментом для управления ферментацией в непрерывном и периодических режимах. В таблице 2 обобщены аппаратурные методы управления факторами среды при использовании ферментера в комплекте с анализатором. При этом в таблице использованы данные о характеристиках анализатора Bioprfile FLEX как самого современного и мощного биотехнологического анализатора на настоящий момент, который способен заменить несколько отдельных приборов или рутинных методик. Bioprofile FLEX позволяет оператору в экспресс-режиме измерять концентрации питательных веществ, метаболитов, осмотическое давление, а также измерять физиологический статус продуцента. Кроме того анализатор может быть интегрирован в контроллер ферментера, а управление подпиткой автоматизировано.

В многочисленных опубликованных статьях описано успешное использование анализаторов Bioprofile или аналогов для решения задач составления оптимальных сред, оптимизации подпитки, увеличения выхода целевого продукта и др. Поэтому использование биотехнологических анализаторов на производствах и в лабораториях является стандартным и доказано эффективным.

Таблица 2.  Основные факторы среды, определяющие рост и биосинтетическую активность продуцентов, аппаратурные способы контроля и управления ими.

Выводы

• При непрерывном и периодическом культивировании актуальна задача экспресс-контроля концентрации питательных веществ и метаболитов в культуральной среде, оценки физиологического состояния продуцента.
• Современные ферментеры позволяют контролировать и управлять основными параметрами культуральной среды, но только с их применение невозможно решить задачу оперативного контроля концентрации питательных веществ и метаболитов, а также изучения физиологического статуса продуцента.
• Использование технологом/оператором биотехнологического производства анализаторов Bioprofile FLEX или аналогов является эффективным и надежным экспресс-инструментом количественного изучения свойств продуцента, концентрации питательных веществ и метаболитов.