Применение анализаторов Bioprofile FLEX при культивировании клеток животных.
Ферментация. Общие сведения.
Под ферментацией понимают всю совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную и нагретую до требуемой температуры среду посевного материала и до завершения процесса роста клеток или биосинтеза целевого продукта. По окончании ферментации образуется сложная смесь, состоящая из клеток продуцента, раствора непотребленных питательных компонентов и накопившихся в среде продуктов биосинтеза. Такую смесь называют культуральной жидкостью.
В зависимости от цели производства — получение клеток или продуктов их жизнедеятельности — способы ведения основной ферментации различаются. Если процесс направлен на получение биомассы, то назначение ферментации — получить максимально возможный титр клеток, а в случае получения метаболитов их накопление осуществляют одновременно, причем максимумы образования продуцента и целевого продукта всегда сдвинуты по времени. Поэтому продолжительность ферментации в первом случае всегда меньше, чем во втором.
Если целью является получение биомассы промышленного штамма в периодическом процессе, то время культивирования не превышает 24 ч. При производстве первичных метаболитов время биосинтеза составляет 48–72 ч, а вторичных — 72–144 ч.
При культивировании различных микроорганизмов интервал рабочих температур варьирует в пределах 25–60°С, значения рН — 2,9, расход воздуха в аэробных процессах — 0,15–2,5 м3/1 м3 среды/мин.
Выделяют несколько способов проведения ферментации – периодические, полупериодический, непрерывный и многоциклический.
Периодический процесс — это такой процесс, когда в ферментер подается посевной материал, задаются определенные технологические параметры (температура, рН, обороты мешалки) и процесс проходит самостоятельно с образованием целевого продукта. Этот процесс экономически не выгоден, т.к. образуется мало целевого продукта.
Полупериодический процесс отличается от периодического процесса тем, что в процессе ферментации в ферментер добавляются различные питательные вещества (источники углеводов, азота), регулируется рН в процессе ферментации, добавляется предшественник в определенный момент ферментации. Полупериодический процесс является экономически выгодным, имея большой выход продукции.
Сущность непрерывного процесса в том, что из ферментера в процессе биосинтеза берется определенное количество культуральной жидкости и вносится в другой ферментер, в котором тоже начинается биосинтез. Культуральная жидкость выполняет функции посевного материала. В ферментер, из которого взяли часть культуральной жидкости, добавляется такое же количество воды и процесс биосинтеза в нем продолжается. Эта операция постоянно повторяется. Используя необходимое количество ферментеров и постоянно перенося часть культуральной жидкости из одного ферментера в другой достигается замкнутый цикл. Преимущество непрерывного процесса в том, что сокращается стадия выращивания посевного материала.
В конце ферментации многоциклического процесса 90% культуральной жидкости сливается из ферментера, а оставшаяся часть выполняет роль посевного материала.
Особенности культивирование клеток животных.
Клетки животных во многом отличаются от прокариотических и грибных клеток: они медленнее растут, у них большая чувствительность к ранению и пузырькам воздуха. Эти свойства клеток оказывают влияние на конструкцию биореакторов и ферментеров, в особенности системы перемешивания и аэрации, которые при работе не должны создавать стрессовых условий для культуры.
Перемешивание должно быть гомогенным, чтобы избежать градиентов температуры и рН, повышенных концентраций субстрата и продуктов. При этом необходимо учитывать чувствительность клеток к ранению. Обычно перемешивание осуществляется большими лопастными мешалками при низких скоростях. Пневматическое (воздушное) перемешивание в эрлифтных реакторах или гидравлическое перемешивание с помощью внешних насосов в реакторах с взвешенной твердой фазой так же решает проблемы, связанные с культивированием.
Для предотвращения пенообразования и повреждения клеток пузырьками воздуха можно уменьшить объем подаваемой газовой смеси, использовать поверхностную продувку или безпузырьковую аэрацию через мембраны. При сокращении объема подаваемого газа необходимо увеличить в нем концентрацию кислорода. Оптимальное снабжение кислородом, азотом, воздухом и углекислым газом создается с помощью систем перемешивания газов.
Выращивание животных клеток можно осуществлять в стационарной (batch), стационарной с подпиткой (fed- batch) или непрерывной (continuous) культуре с задержанием биомассы или без. При стационарном культивировании клетки растут без добавления субстрата после посева культуры. Однако, недостаток субстрата или образование токсичных продуктов метаболизма может снизить продуктивность. Чтобы избежать этих проблем применяют стационарное культивирование с подпиткой, при котором субстрат или другие необходимые вещества добавляют порциями или непрерывно. При непрерывном культивировании продукты метаболизма, ингибирующие рост — лактат, аммоний, удаляют, добавляя компенсирующий объем свежей среды, чтобы избежать недостатка субстрата для роста.
Из-за низкой продуктивности, связанной с медленным ростом, для клеток животных предпочтителен непрерывный процесс культивирования с задержанием клеток (перфузионная система). Это приводит к большей плотности культуры клеток и большему контакту с ними среды, что увеличивает продуктивность. Для задержания биомассы и предотвращения ее выноса с удаляемыми объемами культуральной жидкости используют различные системы фильтрации, например, роторные или вращающиеся фильтры.
Многие клетки млекопитающих растут только будучи прикрепленными к поверхности. Такие опорнозависимые клетки иммобилизуют на микроносителях, таких как стекло, целлюлоза, коллаген, желатин или пластик. Если носитель пористый, клетки могут расти внутри него, при этом они защищены от раневого стресса, что позволяет использовать более высокие скорости перемешивания и продувки в процессе культивирования.
Применение анализаторов Bioprofile FLEX при культивировании клеток животных.
Своевременная подача субстрата в ферментер и вы вывод продуктов метаболизма обеспечивают стабильный рост культуры и повышают эффективность процесса культивирования. Аппаратный комплекс современных ферменетров позволяет контролировать такие параметры культивирования как концентрация кислорода, pH, температуру, но контроль прямых показателей концентрации субстрата (например, глюкозы) или метаболита (например, лактата) осуществляется дополнительным способами и аппаратами. Все большую распространенность для решения этой задачи получают многопараметровые биохимические анализаторы (Bioprofile FLEX), принцип измерения которых основан на технологии биосенсоров. Такие приборы позволяют измерять сразу несколько параметров из одного образца. Время одного анализа составляет 1-2 мин. Анализатор может быть интегрирован в контроллер ферментера, подача питательной среды может осуществляться по показаниям анализатора. Таким образом, современные биотехнологические анализаторы (NOVA Bioprofile FLEX) позволяют решать задачи оптимизации подачи подпитки в ферментер и вывод метаболитов из среды ферментации, и, в конечном счете, добиваться увеличения выхода целевого продукта.
Описание биотехнологического анализатора Bioptofilr FLEX.
Рис.1 Пример результатов измерения биохимического модуля Bioprofile FLEX.
Анализатор BioProfile FLEX сочетает в себе функциональность трех офф-лайн анализаторов (биохимический анализатор, анализатор подсчета клеток, осмометр) в одном устройстве. Анализатор имеет модульную конструкцию, в том числе модули газов/электролитов, питательных веществ/метаболитов, плотности клеток/жизнеспособности, и осмометрический модуль. Газово/электролитный модуль и модуль питательных веществ/метаболитов используют ион-селективные электроды, потенциометрию, амперометрию, и ферментацию, в зависимости от биосенсоров.
Рис.2 Пример результатов измерения модуля осмометрии Bioprofile FLEX.
Модуль плотности/жизнеспособность клеток был разработан Нова Биомедикал для подсчета клеток и оценки жизнеспособности, основанный на традиционном триптофановом синем методе исключения. Сначала образец клеток смешивается с триптофановым синим, и смесь инкубируется так, что мертвые клетки поглощают триптофановый синий. Образец затем оседает на полупрозрачной нижней части проточной ячейки. Проточная ячейка перемещается в фиксированный объектив микроскопа с помощью прецизионной системы управления движением, с высоким разрешением изображений. Подсчет клеток и жизнеспособность определяется путем обработки изображений на основе определяемых пользователем ограничений, таких как живые/мертвые клетки, яркость и средние размеры ячеек.
Рис.3 Пример результатов измерения модуля жизнеспособности/плотности клеток Bioprofile FLEX.
Каждый модуль может быть выбран индивидуально, использование всех модулей BioProfile FLEX требуют всего 1 мл образца культуральной жидкости и 7,5 мин для выполнения анализов. Результаты и пользовательские данный экспортируются в электронном виде в формате электронной таблицы.
Хотя интегрированный анализатор с вводом данных отчасти упорядочивает ручной труд, но только новая уникальная автоматическая система отбора проб, разработанная специально на BioProfile Flex (NOVA Biomedical), позволяет полностью исключить ручной труд.
Многочисленные исследования доказывают успешное применение нового интегрированного многофункционального анализатора и автоматической системы отбора проб для мониторинга клеточных культур млекопитающих. Полученные результаты свидетельствуют, что система имеет потенциал для сокращения ручного труда и связанных с ним погрешностей. При этом процесс измерения может происходить в онлайн режиме без прерывания/нарушения ферментации.
